原代細胞的復蘇步驟

細胞一般儲存在液氮中，溫度達-196℃，理論上儲存時(shí)間是無(wú)限的。細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。

細胞復蘇就是要把原本冷凍保存(凍存)著(zhù)的細胞恢復到一般的生長(cháng)狀態(tài)，今天我們來(lái)看看原代細胞的復蘇步驟。

一、檢查

收到細胞株包裹時(shí)，請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形，若有請立即處理告訴寄方。細胞株請盡速開(kāi)始培養，或立即冷凍保存(置于–70 °C，隔夜后，移到liq N2)。

二、冷凍細胞解凍

1、依據細胞株說(shuō)明書(shū)規定的基礎培養基種類(lèi)、血清種類(lèi)和其它規定之成份和比例，制備培養基。

絕大多數之細胞均無(wú)法立即適應不同基礎培養基或不同的血清種類(lèi)，若因實(shí)驗需要，必須有所不同時(shí)，務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養基組成，確定細胞適應后，方進(jìn)行所需之實(shí)驗。

2、 FBS (fetal bovine serum, 胎牛血清), CS (calfserum, 小牛血清)和HS (horseserum, 馬血清)，對細胞而言差異較大，請務(wù)必依據細胞株資料規定的血清種類(lèi)培養細胞。

3、將培養基置于37 °C 水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺內。取出冷凍管，立即放入37 °C 水槽中快速解凍，水面高度不可接近或高過(guò)冷凍管之蓋沿，否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化后，以70 % ethanol 擦拭冷凍管外部，移入無(wú)菌操作臺內。

4、依據細胞種類(lèi)和濃度，于無(wú)菌操作臺內取10 ml 培養基加至T25 或T75 flask中。取出已解凍之細胞懸浮液，緩緩加入T25 或T75 flask 內之培養基，混合均勻，放入37 °C，5 % CO2 培養箱培養。

5、對絕大多數細胞而言，1 % 以下之冷凍保護劑DMSO，不會(huì )對細胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細胞中去除，待第二天確定細胞生長(cháng)或貼附良好后再去除即可。

對極少數因對DMSO 敏感或會(huì )造成細胞分化之細胞，需立即去除DMSO 者，則可將解凍后之細胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養基中，離心300 xg (約1000 rpm)，5 分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養基，將細胞均勻混合后，轉移至培養瓶中，再放入37 °C， 5 % CO2 培養箱培養。

三、收到T25 flask 細胞時(shí)的處理方式

1. 于寄送過(guò)程中，為避免起泡造成細胞脫落死亡，T25 flask 均加滿(mǎn)培養基。請檢查flask 外觀(guān)，并于顯微鏡下觀(guān)察細胞生長(cháng)狀況和有無(wú)污染現象，若有任何問(wèn)題，不要打開(kāi)蓋子，請立即通知細胞實(shí)驗室。

2. 將原封之T25 flask 靜置于37 °C， 5 % CO2 培養箱中，使細胞回溫至37 °C，并讓運送過(guò)程中少數脫落的細胞可再附著(zhù)生長(cháng)。

隔天后，于無(wú)菌操作箱內取出flask內之培養基，(取出之培養基可以再使用)，僅留約5-10ml 培養基于flask 內，依一般培養方式再將細胞置入培養箱中，或細胞已長(cháng)滿(mǎn)盤(pán)，則將細胞做傳代培養。

四，細胞復蘇注意事項

1、整個(gè)復蘇過(guò)程盡量手腳麻利一些，戰線(xiàn)拉得太長(cháng)可能影響復蘇效果;

2、由于“化冰”這一步里凍存管與水溫差太大，尤其是液氮里來(lái)的凍存管，放到水里可能會(huì )造成翻江倒海的既視感，所以可以用鑷子夾住凍存管往水里摁，這樣即使有炸裂的情況也會(huì )有水做緩沖;

3、取凍存管時(shí)要謹防凍傷，尤其是夏天，盡管熱也盡量穿長(cháng)袖白大褂，一些不經(jīng)意的動(dòng)作可能會(huì )把你的小鮮肉“粘”到冰箱門(mén)上;

4、離心這一步也可以在凍存管里的冰融化后直接進(jìn)行，也就是直接把凍存管離心，離心后棄去原來(lái)的凍存液，然后直接加*培養基重懸細胞，接著(zhù)把細胞轉到培養皿/瓶里培養。這種方法也許不能將DMSO清除得很干凈，但是基本影響不大。

5、 復蘇第二天記得去看看細胞，如果狀態(tài)還不錯的話(huà)就說(shuō)明復蘇成功。