細胞攻略 | MCF 10A(人正常乳腺上皮細胞)

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 細胞正常生長(cháng)形態(tài)照片

細胞名稱(chēng)：MCF 10A(人正常乳腺上皮細胞)

細胞別稱(chēng)： MCF 10A; MCF.10A; MCF10A; MCF10a; MCF-10 Attached; Michigan Cancer Foundation-10A

細胞貨號:   SNL-225

生長(cháng)特性:   貼壁

培養條件:   DMEM+10% FBS+20ng/mL EGF+0.5μg/mL Hydrocortisone+10μg/mL Insulin+1% NEAA+1% P/S

培養環(huán)境:   空氣，95%；二氧化碳 (CO₂)，5%；37℃

細胞簡(jiǎn)介:   MCF 10A細胞于1984年從患有纖維囊性乳房的36歲白人女性的乳腺中分離出來(lái)，來(lái)源于群體中的粘附細胞，是一種非致瘤性上皮細胞系。MCF 10A細胞通過(guò)電子顯微鏡觀(guān)察，顯示出管腔導管細胞的特征，而不是肌上皮細胞的特征，同時(shí)培養基中的鈣含量對細胞的形態(tài)有很大影響。MCF 10A細胞上皮唾液粘液、細胞角蛋白和乳脂球抗原呈陽(yáng)性，還表達通過(guò)與MFA乳腺和MC-5單克隆抗體的陽(yáng)性反應檢測到的乳腺特異性抗原。MCF 10A細胞在膠原蛋白中表現出三維生長(cháng)，并在融合培養物中形成圓頂。到目前為止，細胞還沒(méi)有表現出終末分化或衰老的跡象。MCF 10A細胞對胰島素、糖皮質(zhì)激素、霍亂腸毒素和表皮生長(cháng)因子（EGF）有反應。MCF 10A細胞可以用于3D細胞培養，也是一種合適的轉染宿主。

MCF10A細胞培養注意事項

01 消化時(shí)間長(cháng)

MCF10A細胞消化時(shí)間較長(cháng)，通常需要5min或者更久，具體時(shí)間因胰酶濃度、效價(jià)、消化條件有所不同，第一次對該細胞進(jìn)行消化時(shí)要摸索最佳時(shí)間（具體步驟見(jiàn)后文）。

02對培養基要求高

培養基中胰島素、氫化可的松、表皮生長(cháng)因子、非必須氨基酸等成分對MCF10A的生長(cháng)有著(zhù)關(guān)鍵作用，必須添加這些因子才能正常培養。

MCF10A細胞傳代方法

1.準備所需的培養基、胰酶、PBS、離心管、培養瓶以及無(wú)菌槍頭等；（試劑提前預熱）

2. 抽走培養瓶?jì)扰囵B基，加5mL PBS潤洗1-2遍，清除殘留培養基；

3. 盡量吸干潤洗的PBS后加1mL胰酶，搖晃使胰酶均勻覆蓋瓶底，放置培養箱37℃消化；

4. 消化時(shí)每隔1-2min拿出來(lái)觀(guān)察，鏡下可見(jiàn)細胞明顯回縮，輕拍培養瓶部分細胞開(kāi)始脫落時(shí)，吸取瓶中胰酶將細胞都吹下來(lái)，然后加入3-4mL含血清的培養基終止消化，吹打混勻后立刻離心；

Tips： 

注意控制吹打力度輕柔，吹打次數不可過(guò)多，避免機械損傷

細胞部分脫落后先用胰酶將細胞都吹下來(lái)再終止消化，避免細胞重新貼壁

5. 將細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm，3min離心收集細胞；

6. 在新的培養瓶中加入適量新鮮培養基；（T25推薦10mL，T75推薦15mL）

7. 離心完成后，棄上清，加入適量新鮮培養基輕輕重懸吹散細胞，將細胞懸液均勻接種至培養瓶中，十字法或8字法混勻，然后放入培養箱中繼續培養，注意培養瓶蓋透氣；

Tips：推薦傳代比例1:2-1:4，*次傳代建議1:2。細胞生長(cháng)至80%密度時(shí)即可傳代。

MCF10A細胞凍存方法

1. 配制程序性?xún)龃嬉?，準備相應數量?jì)龃婀懿⒆龊脴擞洝?/span>

Tips：推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完*培養基+8%DMSO

2. 先將細胞按傳代步驟消化、離心、棄上清，獲得細胞沉淀；

3. 加入適量程序性?xún)龃嬉狠p輕重懸細胞，并將細胞懸液轉移至凍存管中；

4. 將凍存管放入程序性?xún)龃婧?，放?80℃冰箱過(guò)夜；

5. 轉移凍存細胞至液氮保存并登記細胞保存位置

Tips：

液氮保存24h后建議復蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長(cháng)期保存。

程序性?xún)龃嬉盒枰浜铣绦蛐詢(xún)龃婧惺褂?，若使用非程序凍存液請按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)處理降溫過(guò)程。

T25培養瓶長(cháng)滿(mǎn)通?？蓛龃?-3管，10cm皿長(cháng)滿(mǎn)通?？蓛龃?-4管。

凍存密度低將導致復蘇后細胞狀態(tài)不佳。

MCF10A細胞復蘇方法

1. 提前將水浴鍋預熱至37℃，培養基復溫至室溫或37℃，離心機設置好轉速；

2. 將細胞從液氮罐取中出，觀(guān)察管內無(wú)液氮的情況下，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃，細胞融化至米粒大小冰塊時(shí)終止水浴，融化過(guò)程不超過(guò)2min；

Tips：

若液氮或冰箱距離細胞房較遠，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。

凍存管在液氮長(cháng)期保存過(guò)程中難免滲入液氮，取出細胞時(shí)震動(dòng)不要過(guò)大。水浴前一定要觀(guān)察管內是否存在液氮，若有液氮需靜置一會(huì )待液氮完*蒸發(fā)后再水浴。做好防護，避免凍存管炸開(kāi)導致受傷。

水浴時(shí)使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。

3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min，不同離心機具體轉速會(huì )有差異

4. 離心完成后棄上清，用預熱的培養基緩慢加入凍存管，輕柔重懸細胞后接種至培養瓶中，輕輕混勻后放入培養箱；

5. 復蘇24小時(shí)后觀(guān)察細胞貼壁情況。

Tips：

1. 整個(gè)細胞復蘇過(guò)程在盡可能5-10min內完成。

2. 該細胞貼壁需要穩定的環(huán)境，復蘇完成后請勿頻繁將細胞拿出觀(guān)察。

MCF10A細胞收貨方法

?常溫細胞

1. 收貨后，拆開(kāi)外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養箱靜置4h以上；

2. 吸走大部分培養基并留10-12 mL，顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片，觀(guān)察細胞密度，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（*次傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續培養至細胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養；

?凍存細胞

1. 細胞收貨后盡快開(kāi)箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內復蘇）短期保存或液氮中長(cháng)期保存，若干冰*全揮發(fā)建議立即復蘇細胞并聯(lián)系銷(xiāo)售人員解決；

2. 凍存細胞建議盡快復蘇一管培養檢查，以免超出售后期，復蘇步驟參考復蘇攻略；

3. 復蘇一管細胞出現異常及時(shí)聯(lián)系銷(xiāo)售人員，在專(zhuān)業(yè)技術(shù)支持的指導下進(jìn)行下一步操作；

Tips：

1. 細胞收貨出現漏液、培養瓶破損、干冰完*揮發(fā)等異常情況時(shí)，及時(shí)拍照聯(lián)系銷(xiāo)售人員；

2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內含對應細胞的完*培養基，可以收集原裝培養瓶?jì)扰囵B基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續細胞培養；

常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

細胞密度怎么計算的？

嚴格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數細胞數量，但在實(shí)際培養過(guò)程中，并不需要為了精確控制細胞數量而消化細胞計數。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長(cháng)密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀(guān)察培養容器底部，有細胞的區域占總區域的百分比值，當然這種表達方式受限于單個(gè)細胞生長(cháng)不同密度時(shí)所占面積不同導致并不嚴謹，但也是相當直觀(guān)、簡(jiǎn)便的表現細胞狀態(tài)的一種方式。

NO.2培養過(guò)程中細胞碎片較多怎么處理？

1. 細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個(gè)屬于細胞自身特性，無(wú)法清除也無(wú)法改變，大部分細胞都會(huì )有這種現象，只是不同細胞顆粒多少有區別，細胞培養體系不適應、營(yíng)養缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議使用合適的培養條件。

2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養基后用PBS潤洗清除，再加新的培養基繼續培養。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞，消化完成后加完*培養基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5mL PBS重懸細胞，再離心后，用完*培養基重懸接種到新的培養皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時(shí)碎片比較少，傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

NO.3細胞具體消化時(shí)間是多久？

每個(gè)實(shí)驗室用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能完*規定消化時(shí)間，以實(shí)際消化效果和實(shí)驗經(jīng)驗為準。 

?產(chǎn)品推薦

 【SNL-225】?MCF 10A(人正常乳腺上皮細胞)

【SNLM-225】MCF 10A細胞專(zhuān)用完*培養基

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