細胞攻略 | RAW 264.7(小鼠單核巨噬細胞白血病細胞) 培養教程

細胞基本信息

▼細胞正常生長(cháng)形態(tài)照片

細胞名稱(chēng)：  RAW 264.7(小鼠單核巨噬細胞白血病細胞)

細胞別稱(chēng)：  RAW264; RAW2647; RAW264.7; RAW-264.7; Raw 264.7; Raw264.7

細胞貨號：  SNL-112

生長(cháng)特性：  半貼壁細胞

培養條件：   DMEM+10% FBS+1% P/S

培養環(huán)境：  空氣，95%；二氧化碳 (CO2)，5%；37℃

細胞簡(jiǎn)介：  RAW 264.7細胞是從Abelson小鼠白血病病毒（MuLV）誘導的腫瘤中建立的雄性小鼠巨噬細胞細胞系，Raschke等人于1976年首*報道了該細胞系。RAW 264.7細胞sIg-、Ia-抗原、Thy-1.2表面抗原陰性。RAW 264.7細胞不分泌可檢測到的病毒顆粒，XC斑點(diǎn)形成試驗陰性。根據Janet W.Hartley博士在2008年發(fā)表的一項研究，RAW 264.7細胞被證明表達生態(tài)性和多向性MuLV，并且使用XC噬斑試驗對病毒復制呈陽(yáng)性。RAW 264.7細胞可以胞飲中性紅并吞噬乳膠顆粒與酵母聚糖，并且可以抗體依賴(lài)性地分解綿羊紅血球與腫瘤靶細胞。LPS或PPD處理2天可誘導RAW 264.7細胞分解紅血球，但對腫瘤靶細胞無(wú)作用。RAW 264.7細胞易于繁殖，DNA轉染效率高，對RNA干擾敏感，并支持小鼠諾如病毒的復制，可以用于3D細胞培養、免疫系統紊亂和免疫學(xué)研究，也是一種合適的轉染宿主。

RAW264.7細胞培養注意事項

1. 存在少量分化細胞

RAW264.7細胞形態(tài)主要為圓形。因其對環(huán)境非常敏感，在培養時(shí)會(huì )出現少量短梭形或多角形的分化細胞，這是正?，F象。分化的細胞貼壁牢固，而未分化的細胞貼壁松散。根據貼壁松緊差異，可將未分化的細胞吹下，并轉移至新的培養器皿中進(jìn)行培養。

2. 對胰酶敏感

RAW264.7細胞對胰蛋白酶敏感，接觸胰酶后將很快發(fā)生自發(fā)分化，貼壁變緊，很難消化下來(lái)。所以不建議用胰酶對該細胞進(jìn)行傳代。（詳細傳代步驟見(jiàn)下文）

3. 生長(cháng)較快

RAW264.7細胞生長(cháng)速度較快，建議每天觀(guān)察細胞密度，當細胞密度到達80%時(shí)及時(shí)進(jìn)行傳代，以防細胞過(guò)度生長(cháng)狀態(tài)變差。

RAW264.7細胞傳代方法

1.準備所需的培養基、胰酶、PBS、離心管、培養瓶以及無(wú)菌槍頭等；（試劑提前預熱）

2. 輕輕吸走培養上清，留 2-3mL 培養基輕輕吹打細胞面吹下細胞；

2. 將細胞懸液轉移至離心管，900rpm 離心 3-5min，棄上清；

3. 加新的完*培養基輕輕重懸細胞，均勻分到新的培養瓶里；

4. 補足完*培養基，將培養瓶放回培養箱靜置培養。

Tips：吹打次數不宜過(guò)多，吹打力度保持輕柔，以免機械刺激造成細胞自分化或損傷。

RAW264.7細胞凍存方法

1. 配制程序性?xún)龃嬉?，準備相應數量?jì)龃婀懿⒆龊脴擞洝?/span>

Tips：推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完*培養基+8%DMSO

2. 先將細胞按傳代步驟獲得細胞沉淀；

3. 加入適量程序性?xún)龃嬉狠p輕重懸細胞，并將細胞懸液轉移至凍存管中；

4. 將凍存管放入程序性?xún)龃婧?，放?80℃冰箱過(guò)夜；

5. 轉移凍存細胞至液氮保存并登記細胞保存位置。

Tips：

液氮保存24h后建議復蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長(cháng)期保存。

程序性?xún)龃嬉盒枰浜铣绦蛐詢(xún)龃婧惺褂?，若使用非程序凍存液請按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)處理降溫過(guò)程。

T25培養瓶長(cháng)滿(mǎn)通?？蓛龃?-3管，10cm皿長(cháng)滿(mǎn)通?？蓛龃?-4管。

凍存密度低將導致復蘇后細胞狀態(tài)不佳。

RAW264.7細胞復蘇方法

1. 提前將水浴鍋預熱至37℃，培養基復溫至室溫或37℃，離心機設置好轉速；

2. 將細胞從液氮罐取中出，觀(guān)察管內無(wú)液氮的情況下，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃，細胞融化至米粒大小冰塊時(shí)終止水浴，融化過(guò)程不超過(guò)2min；

Tips：

若液氮或冰箱距離細胞房較遠，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。

凍存管在液氮長(cháng)期保存過(guò)程中難免滲入液氮，取出細胞時(shí)震動(dòng)不要過(guò)大。水浴前一定要觀(guān)察管內是否存在液氮，若有液氮需靜置一會(huì )待液氮完*蒸發(fā)后再水浴。做好防護，避免凍存管炸開(kāi)導致受傷。

水浴時(shí)使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。

3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min，不同離心機具體轉速會(huì )有差異

4. 離心完成后棄上清，用預熱的培養基緩慢加入凍存管，輕柔重懸細胞后接種至培養瓶中，輕輕混勻后放入培養箱；

5. 復蘇24小時(shí)后觀(guān)察細胞貼壁情況。

Tips：整個(gè)細胞復蘇過(guò)程在盡可能5-10min內完成。

RAW264.7細胞收貨方法

常溫細胞

1. 收貨后，拆開(kāi)外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養箱靜置4h以上；

2. 吸走大部分培養基并留10-12 mL，顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片，觀(guān)察細胞密度，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（首*傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續培養至細胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養；

Tips：若收貨時(shí)發(fā)現懸浮細胞較多，應離心收集懸浮細胞并放回原瓶

凍存細胞

1. 細胞收貨后盡快開(kāi)箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內復蘇）短期保存或液氮中長(cháng)期保存，若干冰完*揮發(fā)建議立即復蘇細胞并聯(lián)系銷(xiāo)售人員解決；

2. 凍存細胞建議盡快復蘇一管培養檢查，以免超出售后期，復蘇步驟參考復蘇攻略；

3. 復蘇一管細胞出現異常及時(shí)聯(lián)系銷(xiāo)售人員，在專(zhuān)業(yè)技術(shù)支持的指導下進(jìn)行下一步操作；

Tips：

1. 細胞收貨出現漏液、培養瓶破損、干冰完*揮發(fā)等異常情況時(shí)，及時(shí)拍照聯(lián)系銷(xiāo)售人員；

2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內含對應細胞的完*培養基，可以收集原裝培養瓶?jì)扰囵B基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續細胞培養；

常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

 細胞密度怎么計算的？

嚴格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數細胞數量，但在實(shí)際培養過(guò)程中，并不需要為了精確控制細胞數量而消化細胞計數。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長(cháng)密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀(guān)察培養容器底部，有細胞的區域占總區域的百分比值，當然這種表達方式受限于單個(gè)細胞生長(cháng)不同密度時(shí)所占面積不同導致并不嚴謹，但也是相當直觀(guān)、簡(jiǎn)便的表現細胞狀態(tài)的一種方式。

NO.2培養過(guò)程中細胞碎片較多怎么處理？

1. 細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個(gè)屬于細胞自身特性，無(wú)法清除也無(wú)法改變，大部分細胞都會(huì )有這種現象，只是不同細胞顆粒多少有區別，細胞培養體系不適應、營(yíng)養缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議使用合適的培養條件。

2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養基后用PBS潤洗清除，再加新的培養基繼續培養。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞，消化完成后加完*培養基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5mL PBS重懸細胞，再離心后，用完*培養基重懸接種到新的培養皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時(shí)碎片比較少，傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

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