染色凋亡試劑盒的實(shí)驗方法和原理

　　染色凋亡試劑盒進(jìn)行PBS清洗時(shí)，每次清洗5min。PBS清洗后，為了各種反應的有效進(jìn)行，請盡量除去PBS溶液后再進(jìn)行下一步反應。在載玻片上的樣本上加上實(shí)驗用反應液后，請蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進(jìn)行，這樣可以使反應液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應液干燥造成實(shí)驗失敗。

　　甲基綠（MethylGreen）染液（3-5%甲基綠溶于0.1M醋酸巴比妥PH4.0）染色后，請用滅菌蒸餾水清洗多余的甲基綠。然后進(jìn)行洗凈（100%乙醇）、脫水（二甲苯）透明、封片后通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀(guān)察操作。如果此時(shí)使用80~90%的乙醇洗凈時(shí)，甲基綠比較容易脫色，注意快速進(jìn)行脫水操作。熒光素標記的dUTP液含甲次鹽和二氯鈷等致癌物，可通過(guò)吸入、口服等途徑進(jìn)入機體，注意防護。

　　染色凋亡試劑盒實(shí)驗方法和原理：

　　細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，目前早期識別仍有困難。這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內轉移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內面，在細胞發(fā)生凋亡時(shí)細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱(chēng)性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。

　　AnnexinV是一種Ca+依賴(lài)的磷脂結合蛋白，發(fā)現是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白，AnnexinV具有易于結合到磷脂類(lèi)如PS的特性。對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。

　　PS轉移到細胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此，可以建立一種用AnnexinV結合在細胞膜表面作為凋亡的指示并結合一種染料排除試驗以檢測細胞膜的完整性的檢測方法。