細胞攻略 | C4-2(人前列腺癌細胞)細胞培養教程

細胞基本信息

 ▲細胞正常生長(cháng)形態(tài)

細胞名稱(chēng)： C4-2(人前列腺癌細胞)

細胞別稱(chēng)： LNCaP-C4-2; LNCaP subline C4-2; C4-2; C42; Sp 2817

細胞貨號： SNL-160

生長(cháng)特性： 貼壁

培養條件： 1640+10% FBS+1% P/S

培養環(huán)境： 空氣，95%；二氧化碳 (CO2)，5%

細胞簡(jiǎn)介： C4-2細胞是從前列腺癌的患者淋巴結轉移中分離出人前列腺癌細胞LNCAP的亞系，通過(guò)將Horoszewiez，JS et al.Cancer Research 43:1809-1818，1983中所述的人前列腺癌細胞系LNCaP（1 x 10^6細胞；29代）與來(lái)自MS骨肉瘤細胞系的人成纖維細胞（1 x 10^6細胞）共同接種到無(wú)胸腺雄性裸鼠中，8周后將裸鼠宿主去勢，總共12周后切除腫瘤標本，體外培養然后得到C4亞系。C4亞系隨后與MS骨肉瘤成纖維細胞在去勢的無(wú)胸腺雄性裸鼠宿主中通過(guò)上述相同的方案共同接種另外12周時(shí)，從該宿主中產(chǎn)生的腫瘤培養的前列腺上皮細胞得到C4-2亞系。致瘤性和骨轉移：在完整和去勢的無(wú)胸腺雄性裸鼠體內原位用1 x 10^6的C4-2細胞可以產(chǎn)生100%的致瘤性（分別為20/20和14/14），在完整和去勢的小鼠宿主中均檢測到骨性前列腺癌轉移（分別為2/20和3/14）。C4-2細胞可以在培養基中分泌前列腺特異性抗原。C4-2細胞可以應用于前列腺癌致瘤性、雄激素非依賴(lài)性增殖和骨轉移研究。

C4-2(人前列腺癌細胞)細胞特點(diǎn)

1.細胞貼壁較弱

細胞貼壁比較弱，因此在遇到運輸低溫及震蕩、室溫靜置太長(cháng)時(shí)間、添加的培養基或其他試劑過(guò)冷、密度較高、聚集未吹散、加液吹打到細胞面等情況時(shí)會(huì )出現明顯的成片脫落現象，此時(shí)若脫落現象不嚴重應盡快放回培養基繼續培養，若呈大片脫落的情況時(shí)需要收集細胞重新消化吹散并接種；

建議使用經(jīng)過(guò)包被或者高貼壁培養瓶培養細胞，盡量避免接觸低溫或密度過(guò)高；

2.細胞本身偏嗜酸性，消耗培養基較快

細胞在略微偏酸性的環(huán)境下生長(cháng)狀態(tài)會(huì )比偏堿性的好，主意培養基pH控制；

細胞密度達到70%以上時(shí)，培養基消耗會(huì )很快，主意及時(shí)觀(guān)察并換液；

3.細胞很難生長(cháng)到匯合

細胞呈島狀生長(cháng)，生長(cháng)是逐漸向外發(fā)射狀增多；

細胞基本無(wú)法生長(cháng)到鋪滿(mǎn)瓶底的情況，很難達到常規意義上100%密度，密度過(guò)高的細胞很容易死亡或者脫落，因此建議在70-80%時(shí)就要傳代細胞；

細胞收貨攻略

01常溫細胞

1.T25瓶收貨后，拆開(kāi)外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養箱靜置2-4h；

2.吸走大部分培養基并留10-12 ml，顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片，觀(guān)察細胞密度，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 ml繼續培養至細胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養；

02凍存細胞

1.細胞收貨后盡快開(kāi)箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內復蘇）短期保存或液氮中長(cháng)期保存，若干冰揮發(fā)建議立即復蘇細胞并聯(lián)系銷(xiāo)售人員解決；

2.凍存細胞建議盡快復蘇一管培養檢查，以免超出售后期，復蘇步驟參考復蘇攻略；

3.復蘇一管細胞出現異常及時(shí)聯(lián)系銷(xiāo)售人員，在專(zhuān)業(yè)技術(shù)支持的指導下進(jìn)行下一步操作；

Tips：

1. 細胞收貨出現漏液、培養瓶破損、干冰揮發(fā)等異常情況時(shí)，及時(shí)拍照聯(lián)系銷(xiāo)售人員；

2. 該細胞貼壁生長(cháng)，T25瓶運輸過(guò)程中經(jīng)常出現大量細胞脫落并聚團的情況，細胞脫落建議按以下步驟處理：

收貨發(fā)現細胞脫落聚集，可以將所有細胞收集起來(lái)，在50ml離心管內離心，上清保存備用，再用PBS重懸細胞，盡量吹散后離心棄上清。沉淀用1ml胰酶重懸，放37度消化2min，先輕輕吹散細胞，再加4ml左右培養基終止消化吹散細胞至無(wú)肉眼可見(jiàn)團塊，離心棄上清，加第一步保存的培養基重懸后接種到新的培養瓶。由于貼壁較弱細胞消化時(shí)間本身較短，注意必須控制消化時(shí)間和吹打力度，避免細胞消化或吹打死亡過(guò)多導致無(wú)法正常貼壁生長(cháng)。由于運輸會(huì )脫落的細胞本身貼壁較弱，建議使用高貼附培養瓶或提前包被過(guò)的培養瓶培養細胞。

3. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內含對應細胞的培養基，可以收集原裝培養瓶?jì)扰囵B基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續細胞培養；

細胞傳代攻略

01先盡量吸干凈T25瓶原培養基，再加3-4ml 常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20s，吸走潤洗的PBS；

02 T25瓶加1ml左右胰酶，輕輕晃動(dòng)培養瓶以使胰酶鋪勻瓶底細胞層，將培養瓶放入37度培養箱消化；

03消化到細胞間隙變大，但未脫落時(shí)加2-3ml培養基終止胰酶消化；

04 混勻細胞，900rpm離心3-5min，棄上清；

05 加新的培養基輕輕重懸細胞，均勻分到新的培養瓶里，補足培養基，將培養瓶放回培養箱靜置培養；

Tips：

1. 對于消化細胞程度，客戶(hù)如果經(jīng)驗不多，無(wú)法準確掌控胰酶作用時(shí)間，建議客戶(hù)按照下述操作：胰酶首先復溫到室溫后加入細胞，放入37度培養箱，然后每隔30秒，即吹打下細胞（此時(shí)吹打細胞應盡量輕柔，不能強行將細胞吹下，否則細胞可能出現機械損傷），如果能夠吹打散細胞，說(shuō)明細胞消化完成可以終止消化，如果30秒吹打不下，再等30秒重復操作直至能夠輕柔的吹下細胞；細胞貼壁較弱，所以消化時(shí)間會(huì )比常規貼壁細胞短很多，注意控制消化時(shí)間；

2. T25瓶加10-12ml培養基，10cm皿加12-15ml，2-3天換液一次。

3. 細胞收貨后傳代建議按1：2傳代，后續培養可以視具體細胞生長(cháng)狀態(tài)和密度情況決定傳代比例；

4. 傳代后24h建議觀(guān)察細胞并換液一次去除死亡細胞；

細胞凍存攻略

凍存步驟

1.先將細胞按傳代步驟消化、離心，至傳代步驟4，棄細胞上清，獲得細胞沉淀；

2.加入適量預先配好的程序性?xún)龃嬉狠p輕重懸細胞，并將細胞懸液轉移至做好標記的凍存管中；

3.將凍存管放入程序性?xún)龃婧?，放?80℃冰箱過(guò)夜；

4.轉移細胞至液氮保存并登記細胞保存位置，液氮保存24h后建議復蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長(cháng)期保存，若低于80%建議重新凍存；

Tips：

1.檢測凍存細胞活性結果未合格前，培養瓶?jì)燃毎ㄗh繼續培養直至確認凍存合格方可視需要丟棄；

2.程序性?xún)龃嬉盒枰浜铣绦蛐詢(xún)龃婧惺褂?，若使用非程序凍存液可以按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)處理降溫過(guò)程；

3.T25培養瓶長(cháng)滿(mǎn)通?？梢?xún)龃?-3管，10cm皿長(cháng)滿(mǎn)可以?xún)龃?-4管；

細胞復蘇攻略

復蘇步驟

1.將所需的培養基放在培養箱預熱30min后開(kāi)始復蘇；

2.準備37度溫水，將細胞從液氮罐取中出，觀(guān)察管內無(wú)液氮的情況下，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入溫水輕輕搖晃，融化至米粒大小冰塊，終止水??；

3.將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心1-2min，不同離心機具體轉速會(huì )有差異；

4.離心完成后棄凍存液，用剛才預熱的培養基緩慢加入凍存管，并輕柔重懸細胞后接種至T25或者10cm皿中，輕輕混勻后放入培養箱；

5.24h后觀(guān)察細胞并換液一次，放回培養箱繼續培養；

Tips：

1.凍存管在液氮長(cháng)期保存過(guò)程中難免滲入液氮，取出細胞時(shí)震動(dòng)不要過(guò)大，水浴前一定要觀(guān)察管內是否存在液氮，若有液氮建議靜置一會(huì )待液氮蒸發(fā)后再水??；

2.水浴時(shí)可以使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，可以降低管蓋縫隙滲入水導致污染的概率；

3.水浴至剩米粒大小時(shí)及時(shí)終止水浴，避免過(guò)度水浴或水浴時(shí)間不足；

4.建議水浴完成后直接在離心管內離心細胞，避免再次轉移細胞；

5.復蘇后的細胞比較脆弱，吹打和轉移細胞時(shí)盡量輕柔，復蘇24h后換液去除死亡細胞；

常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

細胞密度怎么計算的？

嚴格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數細胞數量，但在實(shí)際培養過(guò)程中，并不需要為了精確控制細胞數量而消化細胞計數。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長(cháng)密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀(guān)察培養容器底部，有細胞的區域占總區域的百分比值，當然這種表達方式受限于單個(gè)細胞生長(cháng)不同密度時(shí)所占面積不同導致并不嚴謹，但也是相當直觀(guān)、簡(jiǎn)便的表現細胞狀態(tài)的一種方式；

NO.2培養過(guò)程中細胞碎片較多怎么處理？

1.細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個(gè)屬于細胞自身特性，無(wú)法清除也無(wú)法改變，大部分細胞都會(huì )有這種現象，只是不同細胞顆粒多少有區別，細胞培養體系不適應、營(yíng)養缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議使用合適的培養條件。

2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養基后用PBS潤洗清除，再加新的培養基繼續培養。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞，消化完成后加培養基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細胞，再離心后，用培養基重懸接種到新的培養皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時(shí)碎片比較少，傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

NO.3細胞具體消化時(shí)間是多久？

每個(gè)客戶(hù)用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能規定消化時(shí)間，以實(shí)際消化效果和客戶(hù)經(jīng)驗為準。 

NO.4細胞培養瓶是怎么包被的？

細胞培養瓶包被方法有很多，例如多聚賴(lài)氨酸、明膠、鼠尾膠原等，不同的包被原理和效果都不太一樣，具體可以根據實(shí)際實(shí)驗室條件選擇合適的包被材料。注意包被后應及時(shí)使用，包被后放的時(shí)間越長(cháng)效果越來(lái)越差的。

市面上也有特殊處理的培養瓶可以選擇，常規TC處理或者corning的cellbind型號培養瓶都是不錯的選擇。


產(chǎn)品推薦

【SNL-160】?C4-2(人前列腺癌細胞)

【SNLM-160】C4-2細胞專(zhuān)用培養基