細胞攻略 | HeLa(人宮頸癌細胞)細胞培養教程

細胞基本信息

▲細胞正常生長(cháng)形態(tài)照片

細胞名稱(chēng)：HeLa(人宮頸癌細胞)

細胞別稱(chēng)：HELA; Hela; He La; He-La; HeLa-CCL2; Henrietta Lacks cells; Helacyton gartleri

細胞貨號：SNL-062

生長(cháng)特性：貼壁

培養條件：DMEM+10% FBS+1% P/S

培養環(huán)境：空氣，95%；二氧化碳 (CO2)，5%

細胞簡(jiǎn)介：HeLa細胞是第一個(gè)來(lái)自人體組織經(jīng)連續培養獲得的非整倍體上皮樣細胞系，是由GeyGO等在1951年從31歲女性黑人的宮頸癌組織建立的，經(jīng)原始組織切片重新觀(guān)察，Jones等將其診斷為腺癌。HeLa細胞角蛋白陽(yáng)性，p53表達量較低，但表達正常水平的pRB（視網(wǎng)膜母細胞瘤抑制因子）。HeLa細胞含有人乳頭狀瘤病毒HPV18序列，需在2級生物安全防護臺操作。HeLa細胞可以用于3D細胞培養和生物制品生產(chǎn)，也是一種合適的轉染宿主，還可用于篩選具有侵襲潛力的大腸桿菌菌株。

HeLa(人宮頸癌細胞)特點(diǎn)

1細胞顆粒感較重

細胞傳代培養時(shí)細胞內黑點(diǎn)及細胞外顆粒較多，建議使用優(yōu)質(zhì)血清及培養基培養細胞；

2傳代、復蘇注意細胞狀態(tài)

細胞消化或者復蘇操作不當容易導致細胞死亡裂解產(chǎn)生大量碎片及顆粒，進(jìn)而影響活細胞狀態(tài)，注意消化或復蘇過(guò)程盡量輕柔，嚴格控制消化時(shí)間和復蘇操作規范，傳代或復蘇24h后建議觀(guān)察細胞，建議換液一次去除死亡細胞；

3細胞生長(cháng)較快

細胞生長(cháng)速度較快，注意及時(shí)換液及傳代，平時(shí)培養可以略微多加點(diǎn)培養基；

4細胞極易出現交叉污染

該細胞作為最早建立的人源細胞系，目前已經(jīng)有200余種衍生細胞，該細胞污染并取代了諸多細胞系，在培養過(guò)程中應注意操作，避免交叉污染其他細胞；

細胞收貨攻略

常溫細胞：

1. T25瓶收貨后，拆開(kāi)外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養箱靜置2-4h；

2. 吸走大部分培養基并留10-12 ml，顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片，觀(guān)察細胞密度，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（*次傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 ml繼續培養至細胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養；

凍存細胞：

1. 細胞收貨后盡快開(kāi)箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內復蘇）短期保存或液氮中長(cháng)期保存，若干冰*全揮發(fā)建議立即復蘇細胞并聯(lián)系銷(xiāo)售人員解決；

2. 凍存細胞建議盡快復蘇一管培養檢查，以免超出售后期，復蘇步驟參考復蘇攻略；

3. 復蘇一管細胞出現異常及時(shí)聯(lián)系銷(xiāo)售人員，在專(zhuān)業(yè)技術(shù)支持的指導下進(jìn)行下一步操作；

TIPS

1. 細胞收貨出現漏液、培養瓶破損、干冰*全揮發(fā)等異常情況時(shí)，及時(shí)拍照聯(lián)系銷(xiāo)售人員；

2. 該細胞貼壁生長(cháng)，一般T25瓶運輸過(guò)程中較少出現大量細胞脫落并聚團的情況，少量細胞脫落是正常狀態(tài)，不影響細胞生長(cháng)，按正常操作步驟繼續培養即可。

3. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內含對應細胞的*全培養基，可以收集原裝培養瓶?jì)扰囵B基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續細胞培養；

細胞傳代攻略

01先盡量吸干凈T25瓶原培養基，再加3-4ml 常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20s，吸走潤洗的PBS；

02T25瓶加1ml左右胰酶，輕輕晃動(dòng)培養瓶以使胰酶鋪勻瓶底細胞層，將培養瓶放入37度培養箱消化；

03消化到細胞間隙變大，但未*全脫落時(shí)加2-3ml*全培養基終止胰酶消化；

04混勻細胞，900rpm離心3-5min，棄上清；

05加新的*全培養基輕輕重懸細胞，均勻分到新的培養瓶里，補足*全培養基，將培養瓶放回培養箱靜置培養；

TIPS

1. 對于消化細胞程度，客戶(hù)如果經(jīng)驗不多，無(wú)法準確掌控胰酶作用時(shí)間，建議客戶(hù)按照下述操作：胰酶首先復溫到室溫后加入細胞，放入37度培養箱，然后每隔30秒，即吹打下細胞（此時(shí)吹打細胞應盡量輕柔，不能強行將細胞吹下，否則細胞可能出現機械損傷），如果能夠吹打散細胞，說(shuō)明細胞消化完成可以終止消化，如果30秒吹打不下，再等30秒重復操作直至能夠輕柔的吹下細胞；

2. T25瓶加10-12ml*全培養基，10cm皿加12-15ml，2-3天換液一次。

3. 細胞收貨后*次傳代建議按1：2傳代，后續培養可以視具體細胞生長(cháng)狀態(tài)和密度情況決定傳代比例；

4. 傳代后24h建議觀(guān)察細胞并換液一次去除死亡細胞；

細胞凍存攻略

凍存步驟：

1. 先將細胞按傳代步驟消化、離心，至傳代步驟4，棄細胞上清，獲得細胞沉淀；

2. 加入適量預先配好的程序性?xún)龃嬉狠p輕重懸細胞，并將細胞懸液轉移至做好標記的凍存管中；

3. 將凍存管放入程序性?xún)龃婧?，放?80℃冰箱過(guò)夜；

轉移細胞至液氮保存并登記細胞保存位置，液氮保存24h后建議復蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長(cháng)期保存，若低于80%建議重新凍存；

TIPS

1. 檢測凍存細胞活性結果未合格前，培養瓶?jì)燃毎ㄗh繼續培養直至確認凍存合格方可視需要丟棄；

2. 程序性?xún)龃嬉盒枰浜铣绦蛐詢(xún)龃婧惺褂?，若使用非程序凍存液可以按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)處理降溫過(guò)程；

3. T25培養瓶長(cháng)滿(mǎn)通?？梢?xún)龃?-3管，10cm皿長(cháng)滿(mǎn)可以?xún)龃?-4管；

細胞復蘇攻略

復蘇步驟：

1. 將所需的*全培養基放在培養箱預熱30min后開(kāi)始復蘇；

2. 準備37度溫水，將細胞從液氮罐取中出，觀(guān)察管內無(wú)液氮的情況下，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入溫水輕輕搖晃，融化至米粒大小冰塊，終止水??；

3. 將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心1-2min，不同離心機具體轉速會(huì )有差異；

4. 離心完成后，棄凍存液，用剛才預熱的培養基緩慢加入凍存管，并輕柔重懸細胞后接種至T25或者10cm皿中。

TIPS

1. 凍存管在液氮長(cháng)期保存過(guò)程中難免滲入液氮，取出細胞時(shí)震動(dòng)不要過(guò)大，水浴前一定要觀(guān)察管內是否存在液氮，若有液氮建議靜置一會(huì )待液氮*全蒸發(fā)后再水??；

2. 水浴時(shí)可以使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，可以降低管蓋縫隙滲入水導致污染的概率；

3. 水浴至剩米粒大小時(shí)及時(shí)終止水浴，避免過(guò)度水浴或水浴時(shí)間不足；

4. 建議水浴完成后直接在離心管內離心細胞，避免再次轉移細胞；

5. 復蘇后的細胞比較脆弱，吹打和轉移細胞時(shí)盡量輕柔，復蘇24h后換液去除死亡細胞；

常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

細胞密度怎么計算的？

嚴格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數細胞數量，但在實(shí)際培養過(guò)程中，并不需要為了精確控制細胞數量而消化細胞計數。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長(cháng)密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀(guān)察培養容器底部，有細胞的區域占總區域的百分比值，當然這種表達方式受限于單個(gè)細胞生長(cháng)不同密度時(shí)所占面積不同導致并不嚴謹，但也是相當直觀(guān)、簡(jiǎn)便的表現細胞狀態(tài)的一種方式；

NO.2

培養過(guò)程中細胞碎片較多怎么處理？

1. 細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個(gè)屬于細胞自身特性，無(wú)法清除也無(wú)法改變，大部分細胞都會(huì )有這種現象，只是不同細胞顆粒多少有區別，細胞培養體系不適應、營(yíng)養缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議使用合適的培養條件。

2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養基后用PBS潤洗清除，再加新的培養基繼續培養。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞，消化完成后加*全培養基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細胞，再離心后，用*全培養基重懸接種到新的培養皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時(shí)碎片比較少，傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

NO.3細胞具體消化時(shí)間是多久？

每個(gè)客戶(hù)用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能*全規定消化時(shí)間，以實(shí)際消化效果和客戶(hù)經(jīng)驗為準。

產(chǎn)品推薦

【SNL-062】 HeLa(人宮頸癌細胞)

【SNLM-062】HeLa細胞專(zhuān)用培養基