--細 胞 基 本 信 息---

細胞名稱(chēng)： LLC(小鼠肺癌細胞)

細胞別稱(chēng)： LL/2 (LLC1); LL/2 (LLc1); LL/2(LLc1); LL/2; LL2; LLC1; LLC; Lewis lung carcinoma line 1; Lewis lung carcinoma; Lewis-Lung; Lewis Lung

細胞貨號： SNL-119

生長(cháng)特性： 貼壁

培養條件： DMEM+10% FBS+1% P/S

培養環(huán)境： 空氣，95%； 二氧化碳 (CO2)，5%；37℃

細胞簡(jiǎn)介： LLC細胞是一種從C57BL小鼠的肺中建立的細胞系，該小鼠攜帶由原發(fā)性L(fǎng)ewis肝癌植入引起的腫瘤。LLC細胞對1, 3-雙-（2-氯乙基）-1-亞硝ji脲有抗性，但對甲氨蝶呤敏感。據報道，LLC細胞具有高度致瘤性，可以在C57BL小鼠成瘤，但在小鼠中轉移性較弱。LLC細胞在培養瓶中形成多層，但實(shí)際上沒(méi)有融合。LLC細胞鼠痘病毒陰性，被廣泛用作轉移模型，并有助于研究癌癥化療藥物的機制。

細胞正常生長(cháng)形態(tài)照片

LLC細胞培養注意事項：

1. 形態(tài)多樣

LLC細胞形態(tài)不均一，上皮樣細胞與圓形細胞同時(shí)存在，比例不定，兩種形態(tài)的細胞皆為貼壁狀態(tài)?？赡艽嬖谏倭科〖毎?，當貼壁細胞較多時(shí)，漂浮細胞可以舍棄。當漂浮細胞較多時(shí)，可在換液時(shí)離心收集并接種回原瓶。

2. 細胞生長(cháng)較快

培養時(shí)應加入足量的培養基，避免培養基營(yíng)養快速耗盡導致細胞脫落或狀態(tài)變差。注意關(guān)注培養基顏色變化和細胞密度，培養基變黃后及時(shí)換液，細胞密度到達80%后及時(shí)傳代。

3. 密度較高時(shí)易堆疊生長(cháng)

注意控制細胞密度不要過(guò)高，長(cháng)期高密度培養易導致細胞堆疊生長(cháng)或細胞聚團。

4. 對血清要求高

LLC細胞對血清質(zhì)量較為敏感，需要使用高質(zhì)量胎牛血清進(jìn)行培養。若培養中途更換血清品牌，細胞需要經(jīng)歷一個(gè)過(guò)渡期。（若需更換血清品牌，建議先使用廠(chǎng)家配套的完quan培養基進(jìn)行培養并保種，再更換新品牌血清配制的培養基進(jìn)行測試培養，避免細胞因不適應新血清而損失細胞）

5. 細胞貼壁較弱

該細胞貼壁比較弱，消化時(shí)間偏短，注意控制消化時(shí)間（消化步驟見(jiàn)下文傳代攻略）

。

另外，在遇到快遞運輸震蕩、低溫、室溫靜置太長(cháng)時(shí)間、添加的培養基或其他試劑過(guò)冷等情況時(shí)會(huì )出現明顯的細胞回縮變粗變短甚至脫落的現象，及時(shí)放回培養箱靜置培養后可恢復正常。

平時(shí)注意傳代換液前將培養基、PBS等試劑充分預熱，不要把細胞放在室溫下太長(cháng)時(shí)間。采用T25瓶發(fā)貨，收貨時(shí)可能出現部分細胞漂浮，正確處理后細胞可正常生長(cháng)（處理方法見(jiàn)下文收貨攻略）

LLC細胞傳代攻略

1. 準備所需的培養基、胰酶、PBS、離心管、培養瓶以及無(wú)菌槍頭等；（試劑提前預熱）

2. 先盡量吸干凈T25瓶原培養基，再加5mL 常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20s，吸走潤洗的PBS；

3. T25瓶加1mL胰酶，輕輕晃動(dòng)培養瓶以使胰酶鋪勻瓶底細胞層，將培養瓶放入37度培養箱消化；

4. 消化到細胞明顯回縮，間隙變大，但未完quan脫落時(shí)加2-3mL完quan培養基終止胰酶消化；

Tips：

如果您無(wú)法準確掌控胰酶作用時(shí)間，建議按照下述操作：加入胰酶后，放入37度培養箱消化，然后每隔30秒拿出觀(guān)察，若細胞部分滑落，說(shuō)明消化完成可以終止消化，否則再放回培養箱消化30秒重復操作；細胞貼壁較弱，所以消化時(shí)間會(huì )比常規貼壁細胞短很多，注意控制消化時(shí)間；

5. 混勻細胞并轉移至離心管中，1000rpm離心3min；

6. 在新的培養瓶中加入適量新鮮培養基；（T25推薦10mL，T75推薦20mL）

7. 離心完成后，棄上清，加入適量新鮮培養基輕輕重懸吹散細胞，將細胞懸液均勻接種至培養瓶中，十字法或8字法混勻，然后放入培養箱中繼續培養，注意培養瓶蓋透氣；

Tips：

1. 推薦傳代比例1：2，細胞生長(cháng)至80%密度時(shí)立即傳代。

2. 建議傳代后24h觀(guān)察細胞，若有漂浮死細胞，可通過(guò)換液去除（換液前培養基預熱）

LLC細胞凍存攻略

1. 配制程序性?xún)龃嬉?，準備相應數量?jì)龃婀懿⒆龊脴擞洝?/span>

Tips：推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完quan培養基+8%DMSO

2. 先將細胞按傳代步驟獲得細胞沉淀；

3. 加入適量程序性?xún)龃嬉狠p輕重懸細胞，并將細胞懸液轉移至凍存管中；

4. 將凍存管放入程序性?xún)龃婧?，放?/span>-80℃冰箱過(guò)夜；

5. 轉移凍存細胞至液氮保存并登記細胞保存位置。

Tips：

l 液氮保存24h后建議復蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長(cháng)期保存。

l 程序性?xún)龃嬉盒枰浜铣绦蛐詢(xún)龃婧惺褂?，若使用非程序凍存液請按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)處理降溫過(guò)程。

l T25培養瓶長(cháng)滿(mǎn)通?？蓛龃?-3管，10cm皿長(cháng)滿(mǎn)通?？蓛龃?-4管。

l 凍存密度低將導致復蘇后細胞狀態(tài)不佳。

LLC細胞復蘇方法

1. 提前將水浴鍋預熱至37℃，培養基復溫至室溫或37℃，離心機設置好轉速；

2. 將細胞從液氮罐中取出，觀(guān)察管內無(wú)液氮的情況下，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃，細胞融化至米粒大小冰塊時(shí)終止水浴，融化過(guò)程不超過(guò)2min；

Tips：

l 若液氮或冰箱距離細胞房較遠，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。

l 凍存管在液氮長(cháng)期保存過(guò)程中難免滲入液氮，取出細胞時(shí)震動(dòng)不要過(guò)大。水浴前一定要觀(guān)察管內是否存在液氮，若有液氮需靜置一會(huì )待液氮完quan蒸發(fā)后再水浴。做好防護，避免凍存管炸開(kāi)導致受傷。

l 水浴時(shí)使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。

3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min，不同離心機具體轉速會(huì )有差異

4. 離心完成后棄上清，用預熱的培養基緩慢加入凍存管，輕柔重懸細胞后接種至培養瓶中，輕輕混勻后放入培養箱；

5. 復蘇24小時(shí)后觀(guān)察細胞貼壁情況。

Tips：整個(gè)細胞復蘇過(guò)程在盡可能5-10min內完成。

LLC細胞收貨攻略

l 常溫細胞

1. 收貨后，拆開(kāi)外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養箱靜置4h以上；

2. 吸走大部分培養基并留10-12 mL，顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片，觀(guān)察細胞密度，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（首ci傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續培養至細胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養；

Tips：若收貨時(shí)細胞發(fā)生脫落漂浮，請按以下步驟處理：

1. 先放培養箱靜置4h，所有培養基（1200rpm，5min）離心收集漂浮細胞。

2. 離心完，上清轉移至新的離心管后續可用于培養細胞。用1mL 0.25%胰酶（含EDTA）輕輕吹起細胞沉淀（不要反復吹打），室溫靜置30s后加3mL完培中和胰酶，離心去上清，用新鮮完培重懸混勻細胞。

3. 同時(shí)，貼壁細胞用預熱的PBS輕輕潤洗后加1mL胰酶（勿沖洗），放37度培養箱消化1min，加3mL完培中和胰酶，離心去上清，用新鮮完培重懸混勻細胞。

4.  第2、3步收集的細胞合并起來(lái)，均勻接種到2個(gè)新的T25培養瓶(或6cm皿)中。24h后觀(guān)察細胞狀態(tài)。

l 凍存細胞

1. 細胞收貨后盡快開(kāi)箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內復蘇）短期保存或液氮中長(cháng)期保存，若干冰完quan揮發(fā)建議立即復蘇細胞并聯(lián)系銷(xiāo)售人員解決；

2. 凍存細胞建議盡快復蘇一管培養檢查，以免超出售后期，復蘇步驟參考復蘇攻略；

3. 復蘇一管細胞出現異常及時(shí)聯(lián)系銷(xiāo)售人員，在專(zhuān)業(yè)技術(shù)支持的指導下進(jìn)行下一步操作；

Tips：

1. 細胞收貨出現漏液、培養瓶破損、干冰完quan揮發(fā)等異常情況時(shí)，及時(shí)拍照聯(lián)系銷(xiāo)售人員；

2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內含對應細胞的完quan培養基，可以收集原裝培養瓶?jì)扰囵B基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續細胞培養；

常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

細胞密度怎么計算的？

嚴格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數細胞數量，但在實(shí)際培養過(guò)程中，并不需要為了精確控制細胞數量而消化細胞計數。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長(cháng)密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀(guān)察培養容器底部，有細胞的區域占總區域的百分比值，當然這種表達方式受限于單個(gè)細胞生長(cháng)不同密度時(shí)所占面積不同導致并不嚴謹，但也是相當直觀(guān)、簡(jiǎn)便的表現細胞狀態(tài)的一種方式；

NO.2培養過(guò)程中細胞碎片較多怎么處理？

1. 細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個(gè)屬于細胞自身特性，無(wú)法清除也無(wú)法改變，大部分細胞都會(huì )有這種現象，只是不同細胞顆粒多少有區別，細胞培養體系不適應、營(yíng)養缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議使用合適的培養條件。

2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物，可通過(guò)換液去除，因此每2天正常換液即可，換液前培養基充分預熱。

NO.3細胞具體消化時(shí)間是多久？

每個(gè)客戶(hù)用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能完quan規定消化時(shí)間，以實(shí)際消化效果和客戶(hù)經(jīng)驗為準。 

產(chǎn)品推薦：

【SNL-119】LLC(小鼠肺癌細胞)

【SNLM-119】LLC細胞專(zhuān)用完quan培養基