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細胞攻略 | LLC(小鼠肺癌細胞)培養教程

更新時(shí)間:2024-05-08瀏覽:473次

--細 胞 基 本 信 息---

細胞名稱(chēng) LLC(小鼠肺癌細胞)

細胞別稱(chēng) LL/2 (LLC1); LL/2 (LLc1); LL/2(LLc1); LL/2; LL2; LLC1; LLC; Lewis lung carcinoma line 1; Lewis lung carcinoma; Lewis-Lung; Lewis Lung

細胞貨號 SNL-119

生長(cháng)特性 貼壁

培養條件 DMEM+10% FBS+1% P/S

培養環(huán)境 空氣,95%; 二氧化碳 (CO2),5%;37℃

細胞簡(jiǎn)介 LLC細胞是一種從C57BL小鼠的肺中建立的細胞系,該小鼠攜帶由原發(fā)性L(fǎng)ewis肝癌植入引起的腫瘤。LLC細胞對1, 3-雙-(2-氯乙基)-1-亞硝ji脲有抗性,但對甲氨蝶呤敏感。據報道,LLC細胞具有高度致瘤性,可以在C57BL小鼠成瘤,但在小鼠中轉移性較弱。LLC細胞在培養瓶中形成多層,但實(shí)際上沒(méi)有融合。LLC細胞鼠痘病毒陰性,被廣泛用作轉移模型,并有助于研究癌癥化療藥物的機制。

 

細胞正常生長(cháng)形態(tài)照片

 

 

LLC 40.jpgLLC 100.jpg


LLC細胞培養注意事項:

 

1. 形態(tài)多樣

LLC細胞形態(tài)不均一,上皮樣細胞與圓形細胞同時(shí)存在,比例不定,兩種形態(tài)的細胞皆為貼壁狀態(tài)??赡艽嬖谏倭科〖毎?,當貼壁細胞較多時(shí),漂浮細胞可以舍棄。當漂浮細胞較多時(shí),可在換液時(shí)離心收集并接種回原瓶。

 

2. 細胞生長(cháng)較快

培養時(shí)應加入足量的培養基,避免培養基營(yíng)養快速耗盡導致細胞脫落或狀態(tài)變差。注意關(guān)注培養基顏色變化和細胞密度,培養基變黃后及時(shí)換液,細胞密度到達80%后及時(shí)傳代。

 

3. 密度較高時(shí)易堆疊生長(cháng)

注意控制細胞密度不要過(guò)高,長(cháng)期高密度培養易導致細胞堆疊生長(cháng)或細胞聚團。

 

4. 對血清要求高

LLC細胞對血清質(zhì)量較為敏感,需要使用高質(zhì)量胎牛血清進(jìn)行培養。若培養中途更換血清品牌,細胞需要經(jīng)歷一個(gè)過(guò)渡期。(若需更換血清品牌,建議先使用廠(chǎng)家配套的完quan培養基進(jìn)行培養并保種,再更換新品牌血清配制的培養基進(jìn)行測試培養,避免細胞因不適應新血清而損失細胞)

 

5. 細胞貼壁較弱

該細胞貼壁比較弱,消化時(shí)間偏短,注意控制消化時(shí)間(消化步驟見(jiàn)下文傳代攻略)

。

另外,在遇到快遞運輸震蕩、低溫、室溫靜置太長(cháng)時(shí)間、添加的培養基或其他試劑過(guò)冷等情況時(shí)會(huì )出現明顯的細胞回縮變粗變短甚至脫落的現象,及時(shí)放回培養箱靜置培養后可恢復正常。

平時(shí)注意傳代換液前將培養基、PBS等試劑充分預熱,不要把細胞放在室溫下太長(cháng)時(shí)間。采用T25瓶發(fā)貨,收貨時(shí)可能出現部分細胞漂浮,正確處理后細胞可正常生長(cháng)(處理方法見(jiàn)下文收貨攻略)

 

 

LLC細胞傳代攻略

1. 準備所需的培養基、胰酶、PBS、離心管、培養瓶以及無(wú)菌槍頭等;(試劑提前預熱)

2. 先盡量吸干凈T25瓶原培養基,再加5mL 常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20s,吸走潤洗的PBS;

3. T25瓶加1mL胰酶,輕輕晃動(dòng)培養瓶以使胰酶鋪勻瓶底細胞層,將培養瓶放入37度培養箱消化;

4. 消化到細胞明顯回縮,間隙變大,但未完quan脫落時(shí)加2-3mL完quan培養基終止胰酶消化;

Tips:

如果您無(wú)法準確掌控胰酶作用時(shí)間,建議按照下述操作:加入胰酶后,放入37度培養箱消化,然后每隔30秒拿出觀(guān)察,若細胞部分滑落,說(shuō)明消化完成可以終止消化,否則再放回培養箱消化30秒重復操作;細胞貼壁較弱,所以消化時(shí)間會(huì )比常規貼壁細胞短很多,注意控制消化時(shí)間;

5. 混勻細胞并轉移至離心管中,1000rpm離心3min;

6. 在新的培養瓶中加入適量新鮮培養基;(T25推薦10mL,T75推薦20mL)

7. 離心完成后,棄上清,加入適量新鮮培養基輕輕重懸吹散細胞,將細胞懸液均勻接種至培養瓶中,十字法或8字法混勻,然后放入培養箱中繼續培養,注意培養瓶蓋透氣;

 

Tips:

1. 推薦傳代比例1:2,細胞生長(cháng)至80%密度時(shí)立即傳代。

2. 建議傳代后24h觀(guān)察細胞,若有漂浮死細胞,可通過(guò)換液去除(換液前培養基預熱)

 

LLC細胞凍存攻略

1. 配制程序性?xún)龃嬉?,準備相應數量?jì)龃婀懿⒆龊脴擞洝?/span>

Tips:推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完quan培養基+8%DMSO

2. 先將細胞按傳代步驟獲得細胞沉淀;

3. 加入適量程序性?xún)龃嬉狠p輕重懸細胞,并將細胞懸液轉移至凍存管中;

4. 將凍存管放入程序性?xún)龃婧?,放?/span>-80℃冰箱過(guò)夜;

5. 轉移凍存細胞至液氮保存并登記細胞保存位置。

Tips:

液氮保存24h后建議復蘇一管檢測凍存細胞的活性,若活性合格即可長(cháng)期保存。

程序性?xún)龃嬉盒枰浜铣绦蛐詢(xún)龃婧惺褂?,若使用非程序凍存液請按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)處理降溫過(guò)程。

T25培養瓶長(cháng)滿(mǎn)通??蓛龃?-3管,10cm皿長(cháng)滿(mǎn)通??蓛龃?-4管。

凍存密度低將導致復蘇后細胞狀態(tài)不佳。

 

 

LLC細胞復蘇方法

1. 提前將水浴鍋預熱至37℃,培養基復溫至室溫或37℃,離心機設置好轉速;

2. 將細胞從液氮罐中取出,觀(guān)察管內無(wú)液氮的情況下,捏住管蓋,將細胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃,細胞融化至米粒大小冰塊時(shí)終止水浴,融化過(guò)程不超過(guò)2min;

Tips:

若液氮或冰箱距離細胞房較遠,細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。

凍存管在液氮長(cháng)期保存過(guò)程中難免滲入液氮,取出細胞時(shí)震動(dòng)不要過(guò)大。水浴前一定要觀(guān)察管內是否存在液氮,若有液氮需靜置一會(huì )待液氮完quan蒸發(fā)后再水浴。做好防護,避免凍存管炸開(kāi)導致受傷。

水浴時(shí)使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,避免污染。

 

3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min,不同離心機具體轉速會(huì )有差異

4. 離心完成后棄上清,用預熱的培養基緩慢加入凍存管,輕柔重懸細胞后接種至培養瓶中,輕輕混勻后放入培養箱;

5. 復蘇24小時(shí)后觀(guān)察細胞貼壁情況。

Tips:整個(gè)細胞復蘇過(guò)程在盡可能5-10min內完成。

 

LLC細胞收貨攻略

常溫細胞

1. 收貨后,拆開(kāi)外包裝,用75%酒精消毒T25瓶表面,放37℃培養箱靜置4h以上;

2. 吸走大部分培養基并10-12 mL,顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片,觀(guān)察細胞密度,若細胞密度大于80%即可按比例傳代(首ci傳代比例建議1:2),若細胞密度低于70%可以10-12 mL繼續培養至細胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養;

Tips:若收貨時(shí)細胞發(fā)生脫落漂浮,請按以下步驟處理:

1. 先放培養箱靜置4h,所有培養基1200rpm,5min離心收集漂浮細胞。

2. 離心完,上清轉移至新的離心管后續可用于培養細胞。用1mL 0.25%胰酶(含EDTA)輕輕吹起細胞沉淀(不要反復吹打),室溫靜置30s后加3mL完培中和胰酶,離心去上清,用新鮮完培重懸混勻細胞。

3. 同時(shí),貼壁細胞用預熱的PBS輕輕潤洗后加1mL胰酶(勿沖洗),放37度培養箱消化1min,加3mL完培中和胰酶,離心去上清,用新鮮完培重懸混勻細胞。

4.  第2、3步收集的細胞合并起來(lái),均勻接種到2個(gè)新的T25培養瓶(或6cm皿)中。24h后觀(guān)察細胞狀態(tài)。

 

凍存細胞

1. 細胞收貨后盡快開(kāi)箱檢查,若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱(2-3天內復蘇)短期保存或液氮中長(cháng)期保存,若干冰完quan揮發(fā)建議立即復蘇細胞并聯(lián)系銷(xiāo)售人員解決;

2. 凍存細胞建議盡快復蘇一管培養檢查,以免超出售后期,復蘇步驟參考復蘇攻略;

3. 復蘇一管細胞出現異常及時(shí)聯(lián)系銷(xiāo)售人員,在專(zhuān)業(yè)技術(shù)支持的指導下進(jìn)行下一步操作;

Tips:

1. 細胞收貨出現漏液、培養瓶破損、干冰完quan揮發(fā)等異常情況時(shí),及時(shí)拍照聯(lián)系銷(xiāo)售人員;

2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內含對應細胞的完quan培養基,可以收集原裝培養瓶?jì)扰囵B基經(jīng)1500rpm離心5min后,取上清于4℃保存用于后續細胞培養;

 

 

常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案

細胞密度怎么計算的?

嚴格意義上,細胞密度需要收集細胞懸液計數細胞數量,但在實(shí)際培養過(guò)程中,并不需要為了精確控制細胞數量而消化細胞計數。因此,常用的細胞密度指細胞相對于最大生長(cháng)密度的比值,貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養容器底面積百分比表示,即顯微鏡下觀(guān)察培養容器底部,有細胞的區域占總區域的百分比值,當然這種表達方式受限于單個(gè)細胞生長(cháng)不同密度時(shí)所占面積不同導致并不嚴謹,但也是相當直觀(guān)、簡(jiǎn)便的表現細胞狀態(tài)的一種方式;

 

NO.2培養過(guò)程中細胞碎片較多怎么處理?

1. 細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光,這個(gè)屬于細胞自身特性,無(wú)法清除也無(wú)法改變,大部分細胞都會(huì )有這種現象,只是不同細胞顆粒多少有區別,細胞培養體系不適應、營(yíng)養缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加,建議使用合適的培養條件。

2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物,可通過(guò)換液去除,因此每2天正常換液即可,換液前培養基充分預熱。

 

NO.3細胞具體消化時(shí)間是多久?

每個(gè)客戶(hù)用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣,不能完quan規定消化時(shí)間,以實(shí)際消化效果和客戶(hù)經(jīng)驗為準。 

 

 

產(chǎn)品推薦:

SNL-119】LLC(小鼠肺癌細胞)

SNLM-119】LLC細胞專(zhuān)用完quan培養基


 

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