染色凋亡試劑盒

　　細胞凋亡是指為維持有機體內環(huán)境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。正常情況下任何細胞在形成過(guò)程中發(fā)生的異常都會(huì )通過(guò)凋亡消除。例如體內的癌細胞增長(cháng)為腫瘤的過(guò)程會(huì )受細胞凋亡的引導而被抑制。然而在抑癌基因p53出現問(wèn)題時(shí)，凋亡就不會(huì )誘導發(fā)生，從而導致癌細胞的不斷增長(cháng)。細胞凋亡可以通過(guò)細胞形態(tài)的變化或生物化學(xué)的變化來(lái)檢測。目前常用的指標有caspase活性變化、DNA碎片、磷脂酰絲氨酸的外翻等。

　　染色凋亡試劑盒是一種采用Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide ,PI )雙熒光染色方法進(jìn)行細胞周期與細胞壞死分析的檢測試劑盒。單純的PI染色能夠觀(guān)察DNA直方圖上凋亡細胞的亞G1峰，但只能代表G0/G1期發(fā)生凋亡，無(wú)法觀(guān)察S期和G2期發(fā)生的細胞凋亡，而且細胞經(jīng)過(guò)固定后無(wú)法對活細胞和死細胞進(jìn)行區分。Hoechst 33342可以穿透細胞膜，進(jìn)入正常細胞和凋亡細胞與DNA結合，能在紫外線(xiàn)下顯示藍色熒光，而且染色后凋亡細胞熒光會(huì )比正常細胞明顯增強。PI不能穿透細胞膜，對于具有完整細胞膜的正常細胞或凋亡細胞不能染色。而對于壞死細胞，其細胞膜的完整性喪失，PI可以穿透細胞膜使壞死細胞著(zhù)色產(chǎn)生紅色熒光。

　　檢測與分析：用流式細胞儀在激發(fā)波長(cháng)400～500nm檢測藍色熒光，在大于630nm 處檢測紅色熒光，同時(shí)檢測光散射情況。采用適當分析軟件進(jìn)行細胞DNA含量分析和光散射分析。如果使用熒光顯微鏡檢測，檢測前4℃ 1000g 離心3～5min沉淀細胞，用PBS洗滌一次，再涂片觀(guān)察紅色熒光和藍色熒光。對于貼壁細胞使用熒光顯微鏡檢測，亦可不收集細胞，棄培養液后直接依次按照上述比例加入試劑即可。

　　雙染后，可在流式細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區別開(kāi)來(lái)。在二元直方圖上，正常細胞對Hoechst 33342具有拒染性，呈弱藍色熒光+弱紅色熒光（Hoechst 33342+/PI+）；凋亡細胞對Hoechst 33342具有嗜染性呈強藍色熒光+弱紅色熒光（Hoechst 33342++/PI+）；壞死細胞對PI具有嗜染性，呈弱藍色熒光+強紅色熒光。本試劑盒亦可用熒光顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察，檢測細胞含量范圍一般為0.1~1×106之間。

　　染色凋亡試劑盒試驗注意事項：

　　1、熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題，建議染色后盡快檢測。

　　2、在為了獲得細胞沉淀的離心的過(guò)程中，對于特殊細胞，如果細胞沉淀不充分，可以適當提高離心力或延長(cháng)離心時(shí)間。

　　3、Hoechst 33342與細胞孵育的時(shí)間不宜過(guò)長(cháng)，一般控制在20 min以?xún)?。太長(cháng)容易引起Hoechst 33342的發(fā)射光譜由藍光向紅光遷移，導致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變。